Besinsel Lİf Analizi

Besinsel Lif

Besinsel Lif Analizi Kullanılan Kimyasallar Toplam Besinsel Lif Kiti (Merck 1.12979) :  α -amylase çözeltisi                      5 mL                                                                             Protease çözeltisi                          5 mL                                                                             Amyloglucosidase çözeltisi          3x15 mL      MES/TRİS tamponu: 19.52 g  2(N-morfolin)etan sülfonik asit (MES) (Merck1.06126) ve 14.2g tris(hidroksimetil)aminometan (TRİS) (Merck1.08382) 1.7 L deiyonize suda çözülür. Çözeltinin pH’ sı 6 N NaOH ile 8.2’ ye ayarlanır. Çözeltinin son hacmi 2 L ye saf su ile tamamlanır. 0.561 N HCl asit çözeltisi: 700 mL saf su üzerine 93.5 ml 6 N HCl asit koyularak 1Lt ye tamamlanır. %95‘ lik etil alkol :95 mL mutlak (Merck 1.00983) etanol üzerine 5 mL saf su eklenir %78‘ lik etil alkol : 78 mL mutlak (Merck 1.00983) etanol üzerine 5 mL saf su eklenir Aseton (Merck 1.00014) Petrol Eteri (Merck 1.01775) Kullanılan Malzemeler 50 mL Falcon tüpü Gooch krozesi Tüplük (50 mLFalcon tüpüne uygun) Su banyosu Vakum pompası veya su trompu Erlen (250 mL) Nuche erleni Etüv Pipet (5,10 mL) Mikropipet (0-250µl aralığında) Vortex Deneyin yapılışı Eğer örnek %5 ten fazla yağ içeriyor ise örnekteki yağ uzaklaştırılır. Örnek 3 defa 25 mL petrol eteri ile çalkalanıp süzülür. Daha sonra elde edilen yağsız örnek 70 C°’ da 2-3 saat kurutulur. Yağsız örnek  boyutu 0.3-0.5 mm mesh olacak şekilde öğütülür. Enzimatik parçalanma: 50 mL falcon tüplerine1 g örnek tartılır. Üzerine 40 mL MES/TRIS çözeltisi eklenerek çözelti vortexlenir. 50 µl α -amylase çözeltisi eklenir, vortexlenir, 95-100C° ‘da 30 dakika bekletilir. Çözelti 60 C°’a soğutulur. 50 µl protease çözeltisi eklenir, vortexlenir, 60 C°’da -  30 dakika bekletilir. 5 mL 0.561 N HCL eklenerek çözeltinin pH 4.1-4.8 aralığına getirilir. 150 µl amyloglucosidase çözeltisi eklenir, vortexlenir, 60 C° -  30 dakika bekletilir.  Toplam Besinsel Lif analizi yapılıcak ise; Enzimatik parçalanma işlemi bittikten sonra örnek bir erlene 60 C° sıcaklıktaki 220 mL etanol  ile yıkanarak aktarılır. Çözelti ağzı kapatılarak 1 saat bekletir. Vakum yardımı ile daha önce sabit tartıma getirilmiş gooch krozesinden süzlür Çökelek %78’lik etanol (3x15 mL) , %95’lik etanol (2x10 mL) ve  aseton (3x10 mL) ile yıkanır. 105 C°’da 1 gece etüvde bekletilir. Tartım alınır (m2) Parallerden birinde kül (k), diğerinde protein (p) analizi yapılır. Çözünen ve Çözünmeyen  Besinsel Lif analizleri yapılacak ise;Amyloglucosidase enzimi eklenip 30 dakika beklendikten sonra çözelti daha önceden sabit tartıma getirilen gooch krozesinden süzülür. Çökelek 70 C° sıcaklıktaki saf su ile (2x10mL) yıkanır. Çökelek ile çözünmeyen besinsel lif, çözelti ile ise çözünen besinsel lif analizi yapılır. Çözünen Besinsel Lif analizi; Süzüntünün ağırlığı 80 g olana kadar saf su eklenir Önceden 60°C’ye ısıtılmış % 95 ‘ lik 320 ml etanol eklenir Çökme işleminin tamamlanması için 1 saat bekletilir. Çözelti sabit tartıma getirilmiş gooch krozesinden (cam kroze) süzülür. Çökelek %78 ‘lik etanolle (3x15 ml), %95’ lik etanolle (2x10 ml ) ve son olarak asetonla (3x10 ml ) yıkanır. 105 C°’da 1 gece etüvde bekletilir. Tartım alınır (m3) Parallerden birinde kül (k), diğerinde protein (p) analizi yapılır. Çözünmeyen Besinsel Lif analizi; Çökelek % 95’lik etanol ile (2x10mL) ve aseton ile (2x10mL) yıkanır. 105 C°’da 1 gece etüvde bekletilir. Tartım alınır (m4) Parallerden birinde kül (k), diğerinde protein (p) analizi yapılır. Hesaplamalar Kül ve protein deney sonuçları bazen negatif sonuc verebilir. Negatif değerler hesaplamalara katılmamalıdır. % Toplam diyet lif = [(m2 - m1) -( k+ p ) x100] /  m % Çözünmeyen Diyet Lif = [(m4 - m1) - ( k+ p ) x100] / m % Çözünen Diyet Lif = [(m3 - m1) - ( k+ p ) x100] /  m m: alınan örnek miktarı Not: Analiz, örnek miktarı ve buna bağlı olarak kimyasalların miktarları 4 'e bölünerek yapılabilinir (denenmiştir). Hangi firmanın enzimleri kullanılacak ise enzim aktiviteleri nedeniyle enzim miktarları  firmanın belirttigi miktarlarda kullanılmalıdır.  Protein analizi, sonucun genellikle 0 çıkması nedeniyle yapılmamaktadır.